Обо всех рнк на свете, больших и малых. Большие дела небольших молекул: как малые РНК дирижируют генами бактерий Функции малых рнк

Метафора, лежащая в основе названия явления РНК-интерференции, отсылает к опыту с петунией, когда искусственно введённые в растение гены синтетазы розового и фиолетового пигментов не увеличили интенсивность окраски, а, наоборот, уменьшили её. Аналогично, в «обычной» интерференции наложение двух волн может приводить к взаимному «гашению».

В живой клетке поток информации между ядром и цитоплазмой никогда не иссякает, однако понимание всех его «завихрений» и расшифровка закодированной в нём информации – воистину титаническая задача. Одним из важнейших рывков в биологии прошлого века можно считать открытие молекул информационных (или матричных) РНК (иРНК или мРНК), которые служат посредниками, переносящими информационные «сообщения» из ядра (с хромосом) в цитоплазму. Определяющая роль РНК в синтезе белков была предсказана ещё в 1939 году в работе Торбьёрна Касперссона (Torbjörn Caspersson), Жана Брачета (Jean Brachet) и Джека Шульца (Jack Schultz), а в 1971 году Джордж Марбайс (George Marbaix) запустил синтез гемоглобина в ооцитах лягушки, сделав инъекцию впервые выделенной матричной РНК кролика, кодирующей этот белок .

В 1956-57 годах в Советском Союзе А. Н. Белозерский и А. С. Спирин независимо доказали существование мРНК, а также выяснили, что основную массу РНК в клетке составляет отнюдь не матричная, а рибосомальная РНК (рРНК). Рибосомальная РНК – второй «главный» вид клеточной РНК – образует «скелет» и функциональный центр рибосом у всех организмов; именно рРНК (а не белки) регулирует основные этапы белкового синтеза. Одновременно был описан и изучен и третий «главный» вид РНК – транспортные РНК (тРНК), которые в комплексе с двумя другими – мРНК и рРНК – формируют единый белок-синтезирующий комплекс. Согласно достаточно популярной гипотезе «мира РНК», именно эта нуклеиновая кислота лежала у самых истоков жизни на Земле .

В связи с тем, что РНК значительно более гидрофильна по сравнению с ДНК (за счет замены дезоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке, а значит и доставлять короткоживущие реплики генетической информации (мРНК) к месту, где начинается белковый синтез. Однако стоит отметить и связанное с этим «неудобство» – РНК очень нестабильна. Она намного хуже, чем ДНК, хранится (даже внутри клетки) и деградирует при малейшей перемене условий (температура, рН). Кроме «собственной» нестабильности, большой вклад принадлежит рибонуклеазам (или РНКазам) – классу расщепляющих РНК ферментов, очень стабильных и «вездесущих» – даже кожа рук экспериментатора содержит достаточное количество этих ферментов, чтобы перечеркнуть весь эксперимент. Из-за этого работать с РНК намного сложнее, чем с белками или ДНК – последняя вообще может храниться сотни тысяч лет практически без повреждений .

Фантастическая аккуратность при работе, тридистиллят, стерильные перчатки, одноразовая лабораторная посуда – всё это необходимо для предотвращения деградации РНК, однако соблюдение таких стандартов не всегда было возможным. Поэтому долгое время на короткие «обломки» РНК, неизбежно загрязнявшие растворы, попросту не обращали внимания. Однако со временем стало ясно, что, несмотря на все усилия по поддержанию стерильности рабочей области, «обломки» закономерно продолжали обнаруживаться, а потом выяснилось, что в цитоплазме всегда присутствуют тысячи коротких двуцепочечных РНК, выполняющих вполне определённые функции, и абсолютно необходимых для нормального развития клетки и организма.

Принцип РНК-интерференции

Сегодня изучение малых регуляторных РНК является одной из наиболее бурно развивающихся областей молекулярной биологии. Обнаружено, что все короткие РНК выполняют свои функции на основе явления, названного РНК-интерференцией (суть этого феномена заключается в подавлении экспрессии гена на стадии транскрипции или трансляции при активном участии малых молекул РНК). Очень схематично механизм РНК-интерференции показан на рис.1:

Рис. 1. Основы РНК-интерференции
Двуцепочечные молекулы РНК (дцРНК) нехарактерны для нормальных клеток, но они являются обязательным этапом жизненного цикла многих вирусов. Специальный белок Dicer, обнаружив в клетке дцРНК, «режет» её на небольшие фрагменты. Антисмысловая цепь такого фрагмента, которую уже можно называть короткой интерферирующей РНК (киРНК, от siRNA – small interference RNA), связывается комплексом белков под названием RISC (RNA-induced silencing complex), центральный элемент которого – эндонуклеаза семейства Argonaute. Связывание с киРНК активирует RISC и запускает в клетке поиск молекул ДНК и РНК, комплементарных «шаблонной» киРНК. Судьба таких молекул – быть уничтоженными или инактивированными комплексом RISC.

Подытоживая, короткие «обрезки» чужеродной (в том числе, введённой намеренно) двуцепочечной РНК служат «шаблоном» для широкомасштабного поиска и уничтожения комплементарных мРНК (а это эквивалентно подавлению экспрессии соответствующего гена), – причем, не только в одной клетке, но и в соседних. Для многих организмов – простейших, моллюсков, червей, насекомых, растений – этот феномен является одним из основных способов иммунной защиты против инфекций.

В 2006 году Эндрю Файер (Andrew Fire) и Крейг Мелло (Craig Mello) получают Нобелевскую премию по физиологии и медицине «За открытие явления РНК-интерференции – механизма сайленсинга генов при участии дцРНК». Хотя сам феномен РНК-интерференции был описан задолго до того (ещё в начале 1980-х), именно работы Файера и Мелло в общих чертах определили регуляторный механизм малых РНК и обрисовали неведомую до той поры область молекулярных исследований. Вот основные результаты их работ:

• При РНК-интерференции расщепляется именно мРНК (и никакая другая);
• Двуцепочечная РНК действует (вызывает расщепление) значительно эффективнее одноцепочечной. Эти два наблюдения предсказывали существование специализированной системы, опосредующей действие дцРНК;
• дцРНК, комплементарная участку зрелой мРНК, вызывает расщепление последней. Это указывало на цитоплазматическую локализацию процесса и наличие специфической эндонуклеазы;
• Небольшого количества дцРНК (нескольких молекул на клетку) достаточно для полного «выключения» целевого гена, что указывает на существование каскадного механизма катализа и/или амплификации.

Эти результаты заложили фундамент целому направлению современной молекулярной биологии – РНК-интерференции – и определили вектор работы множества исследовательских групп по всему миру не на один десяток лет. К текущему моменту обнаружено три большие группы малых РНК, которые играют на молекулярном поле за «команду РНК-интерференции». Познакомимся с ними подробнее.

Игрок № 1 – короткие интерферирующие РНК

Специфичность РНК-интерференции определяется короткими интерферирующими РНК (киРНК) – небольшими двуцепочечными молекулами РНК с чётко определённой структурой (см. рис.2).

киРНК эволюционно наиболее ранние, и распространены шире всего у растений, одноклеточных организмов и беспозвоночных . У позвоночных в норме киРНК практически не обнаружены, потому что их вытеснили более поздние «модели» коротких РНК (см. далее).

киРНК – «шаблоны» для поиска в цитоплазме и уничтожения молекул мРНК – имеют длину 20–25 нуклеотидов и «особую примету»: по 2 неспаренных нуклеотида на 3’-концах и фосфорилированные 5’-концы. Анти-смысловая киРНК способна (не сама, конечно, а с помощью RISC-комплекса) распознавать мРНК и специфически вызывать её деградацию: разрез целевой мРНК всегда происходит точно в месте, комплементарном 10 и 11 нуклеотидам анти-смысловой цепи киРНК.

Рис. 2. Механизм «интерференции» мРНК и киРНК
«Интерферирующие» короткие молекулы РНК могут как попадать в клетку извне, так и «нарезаться» уже на месте из более длинных двуцепочечных РНК. Основной белок, необходимый для «нарезания» дцРНК, – эндонуклеаза Dicer. «Выключение» гена по механизму интерференции осуществляется киРНК совместно с белковым комплексом RISC, который состоит из трёх белков – эндонуклеазы Ago2 и двух вспомогательных белков PACT и TRBP. Позже было обнаружено, что комплексы Dicer и RISC могут использовать в качестве «затравки» не только дцРНК, но и одноцепочечную РНК, формирующую двуцепочечную шпильку, а также готовую киРНК (последняя минует стадию «нарезания» и сразу связывается с RISC).

Функции киРНК в клетках беспозвоночных достаточно разнообразны. Первая и основная – это иммунная защита. «Традиционная» иммунная система (лимфоциты + лейкоциты + макрофаги) присутствует лишь у сложных многоклеточных организмов. У одноклеточных же, беспозвоночных и растений (у которых такой системы либо нет, либо она находится в зачаточном состоянии) иммунная защита строится на основе РНК-интерференции. Иммунитет, основанный на РНК-интерференции, не нуждается в сложных органах «тренировки» предшественников иммунных клеток (селезенка, тимус); в то же время, многообразие теоретически возможных последовательностей коротких РНК (421 вариантов) соотносимо с числом возможных белковых антител высших животных. Кроме того, киРНК синтезируются на основе инфицировавшей клетку «враждебной» РНК, а значит, в отличие от антител, они сразу «затачиваются» под конкретный тип инфекции. И хотя вне клетки защита на основе РНК-интерференции не работает (по крайней мере, таких данных пока нет), внутриклеточный иммунитет она обеспечивает более чем удовлетворительно.

Прежде всего, киРНК создаёт антивирусный иммунитет, уничтожая мРНК или геномную РНК инфекционных организмов (например, так киРНК и были открыты у растений ). Введение вирусной РНК вызывает мощную амплификацию специфических киРНК на основе молекулы-затравки – самой вирусной РНК. Кроме того, киРНК подавляют экспрессию различных мобильных генетических элементов (МГЭ), а значит, обеспечивает защиту и от эндогенных «инфекций». Мутации в генах RISC-комплекса часто ведут к повышению нестабильности генома из-за высокой активности МГЭ; киРНК может быть ограничителем экспрессии собственных генов, срабатывая в ответ на их гиперэкспрессию. Регуляция работы генов может происходить не только на уровне трансляции, но и во время транскрипции – через метилирование генов по гистону Н3.

В современной экспериментальной биологии значение РНК-интерференции и коротких РНК трудно переоценить. Разработана технология «выключения» (или нокдауна) отдельных генов in vitro (на культурах клеток) и in vivo (на эмбрионах), что уже стало стандартом de facto при изучении любого гена. Иногда даже, чтобы установить роль отдельных генов в каком-нибудь процессе, проводят систематическое «выключение» всех генов по очереди .

Возможностью применения киРНК заинтересовались и фармацевты, поскольку способность направленной регуляции работы отдельных генов сулит неслыханные перспективы в лечении массы заболеваний. Небольшой размер и высокая специфичность действия обещают высокую эффективность и низкую токсичность лекарств на основе киРНК; однако решить проблему доставки киРНК к больным клеткам в организме пока не удалось – виной тому хрупкость и недолговечность этих молекул. И хотя сейчас десятки коллективов пытаются найти способ направлять эти «волшебные пули» точно в цель (внутрь больных органов), видимых успехов они пока не достигли. Кроме этого, есть и другие сложности. Например, в случае антивирусной терапии высокая избирательность действия киРНК может оказать «медвежью услугу» – поскольку вирусы быстро мутируют, изменённый штамм очень быстро потеряет чувствительность к киРНК, подобранной в начале терапии: известно, что замена всего лишь одного нуклеотида в киРНК приводит к существенному снижению эффекта интерференции.

В этом месте стоит напомнить ещё раз – киРНК были обнаружены только у растений, беспозвоночных и одноклеточных; хотя гомологи белков для РНК-интерференции (Dicer, RISC-комплекс) присутствуют и у высших животных, киРНК привычными методами не обнаруживались. Каково же было удивление, когда искусственно введённые синтетические аналоги киРНК вызывали сильный специфический дозозависимый эффект в культурах клеток млекопитающих! Это означало, что в клетках позвоночных РНК-интерференция не заместилась более сложными системами иммунитета, а эволюционировала вместе с организмами, превратившись во что-то более «продвинутое». Следовательно, у млекопитающих надо было искать не точные аналоги киРНК, а их эволюционных преемников.

Игрок № 2 – микроРНК

Действительно, на основе эволюционно достаточно древнего механизма РНК-интерференции у более развитых организмов появились две специализированные системы управления работой генов, использующие каждая свою группу малых РНК – микроРНК (microRNA) и пиРНК (piRNA, Piwi-interacting RNA). Обе системы появились ещё у губок и кишечнополостных и эволюционировали вместе с ними, вытеснив киРНК и механизм «голой» РНК-интерференции. Их роль в обеспечении иммунитета снижается, поскольку эту функцию взяли на себя более совершенные механизмы клеточного иммунитета, – в частности, интерфероновая система. Однако эта система настолько чувствительна, что срабатывает и на саму киРНК: появлении в клетке млекопитающих малых двуцепочечных РНК запускает «сигнал тревоги» (активирует секрецию интерферона и вызывает экспрессию интерферон-зависимых генов, что блокирует все процессы трансляции целиком). В этой связи механизм РНК-интерференции у высших животных опосредован в основном микроРНК и пиРНК – одноцепочечными молекулами со специфической структурой, которая не обнаруживаются интерфероновой системой.

По мере усложнения генома микроРНК и пиРНК принимали всё большее участие в регуляции транскрипции и трансляции. Со временем, они превратились в дополнительную, точную и тонкую систему регуляции генома. В отличие от киРНК, микроРНК и пиРНК (открыты в 2001 году, см. рис.3, А-В) не производятся из чужеродных двуцепочечных молекул РНК, а изначально закодированы в геноме организма-хозяина .

Предшественник микроРНК транскрибируется с обеих цепей геномной ДНК РНК-полимеразой II, в результате чего появляется промежуточная форма – при-микроРНК, – несущая признаки обычной мРНК – m7G-кэп и полиА-хвост. В этом предшественнике образуется петля с двумя одноцепочечными «хвостами» и несколькими неспаренными нуклеотидами в центре (рис. 3А). Такая петля подвергается двухстадийному процессингу (рис. Б): вначале эндонуклеаза Drosha отрезает от шпильки одноцепочечные «хвосты» РНК, после чего вырезанная шпилька (пре-микроРНК) экспортируется в цитоплазму, где узнается Dicer’ом, вносящим ещё два разреза (вырезается двуцепочечный участок, обозначенный цветом на рис. 3А). В таком виде зрелая микроРНК, аналогично киРНК, включается в состав комплекса RISC.

Механизм действия многих микроРНК аналогичен действию киРНК: короткая (21–25 нуклеотидов) одноцепочечная РНК в составе белкового комплекса RISC с высокой специфичностью связывается с комплементарным участком в 3’-нетранслируемой области мРНК-мишени. Связывание приводит к расщеплению мРНК белком Ago. Однако активность микроРНК (по сравнению с киРНК) уже более дифференцирована – если комплементарность не абсолютная, целевая мРНК может не деградировать, а только обратимо блокироваться (трансляции не будет). Тот же RISC-комплекс может использовать и искусственно введённые киРНК. Это объясняет, почему киРНК, сделанные по аналогии с простейшими, активны и у млекопитающих.

Таким образом, мы можем дополнить иллюстрацию механизма действия РНК-интерференции у высших (билатерально-симметричных) организмов, объединив на одном рисунке схему действия микроРНК и биотехнологически введённых киРНК (рис. 3В).

Рис. 3А: Структура двуцепочечной молекулы-предшественника микроРНК
Основные особенности: наличие консервативных последовательностей, которые формируют шпильку; наличие комплементарной копии (микроРНК*) с двумя «лишними» нуклеотидами на 3’-конце; специфическая последовательность (2–8 п. н.), формирующая сайт узнавания для эндонуклеаз. Сама микроРНК выделена красным цветом – именно её и вырезает Dicer.

Рис. 3Б: Общий механизм процессинга микроРНК и реализации её активности

Рис. 3В: Обобщённая схема действия искусственных микроРНК и киРНК
Искусственные киРНК вводятся в клетку с помощью специализированных плазмид (targeting siRNA vector).

Функции микроРНК

Физиологические функции микроРНК крайне разнообразны – фактически, они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. микроРНК не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляцию генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.). Кроме того, синтез самих микроРНК сложным образом регулируются (определенные пулы микроРНК могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей α (ФНО-α) и многими другими цитокинами). В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть настройки «оркестра» из тысяч генов, но и этим дело не заканчивается.

микроРНК более «универсальны», чем киРНК: «подопечные» гены не обязательно должны быть на 100% комплементарны – регуляция осуществляется и при частичном взаимодействии. На сегодня одна из самых горячих тем в молекулярной биологии – поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами известных физиологических процессов. Например, уже описаны микроРНК, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза у растений, дрозофилы и нематоды; у человека микроРНК регулируют иммунную систему и развитие гематопоэтических стволовых клеток . Применение технологий на основе биочипов (micro-array screening) показало, что на различных этапах жизни клеток включаются и выключаются целые пулы малых РНК. Для биологических процессов идентифицировали десятки специфичных микроРНК, уровень экспрессии которых в определённых условиях изменяется в тысячи раз, подчёркивая исключительную управляемость этих процессов.

До недавнего времени считалось, что микроРНК только подавляют – полностью или частично – работу генов. Однако недавно оказалось: действие микроРНК может кардинально отличаться в зависимости от состояния клетки! В активно делящейся клетке микроРНК, связавшись с комплементарной последовательностью в 3’-участке мРНК, ингибирует синтез белка (трансляцию). Однако в состоянии покоя или стресса (например, при росте на бедной среде) то же самое событие приводит к прямо противоположному эффекту – усилению синтеза целевого белка !

Эволюция микроРНК

Количество разновидностей микроРНК у высших организмов ещё до конца не установлено – по некоторым данным, оно превосходит 1% от числа белок-кодирующих генов (у человека, например, говорят о 700 микроРНК, и это число постоянно растет). микроРНК регулируют активность около 30% всех генов (мишени для многих из них пока не известны), причём существуют как повсеместно распространённые, так и тканеспецифичные молекулы – например, один такой важный пул микроРНК регулирует созревание стволовых клеток крови.

Широкий профиль экспрессии в разных тканях разных организмов и биологическая распространённость микроРНК говорит об эволюционно древнем происхождении. Впервые микроРНК обнаружили у нематод, и долгое время потом считали, что эти молекулы появляются лишь у губок и кишечнополостных; однако позже их открыли и в одноклеточных водорослях . Интересно, что по мере усложнения организмов увеличивается также количество и гетерогенность пула микроРНК. Это косвенно свидетельствует о том, что сложность этих организмов обеспечивается, в частности, функционированием микроРНК . Возможная эволюция микроРНК показана на рис.4.

Рис. 4. Многообразие микроРНК у разных организмов
Чем выше организация организма, тем больше у него обнаруживается микроРНК (число в скобках). Красным выделены виды, у которых обнаружены единичные микроРНК. По данным .

Между киРНК и микроРНК можно провести чёткую эволюционную связь, опираясь на следующие факты:

• действие обоих видов взаимозаменяемо и опосредуется гомологичными белками;
• киРНК, введённые в клетки млекопитающих, специфично «выключают» нужные гены (несмотря на некоторую активацию интерфероновой защиты);
• микроРНК обнаруживаются у всё более и более древних организмов.

Эти и другие данные позволяют предположить происхождение обеих систем от общего «предка». Интересно также отметить, что «РНКовый» иммунитет как независимый предшественник белковых антител подтверждает теорию зарождения первых форм жизни на основе РНК, а не белков (напомним, что это любимая теория академика А. С. Спирина ).

Пока на арене молекулярной биологии было только два «игрока» – киРНК и микроРНК – основное «предназначение» РНК-интерференции казалось совершенно понятным. Действительно: набор гомологичных коротких РНК и белков у разных организмов осуществляет аналогичные действия; по мере усложнения организмов усложняется и функциональность.

Однако в процессе эволюции природа создала ещё одну, эволюционно самую позднюю и узкоспециализированную систему на основе всё того же удачного принципа РНК-интерференции. Речь идет пиРНК (piRNA, от Piwi-interaction RNA).

Чем сложнее организован геном, тем более развит и приспособлен организм (или наоборот? ;-). Однако увеличение сложности генома имеет и оборотную сторону: сложная генетическая система становится нестабильной. Это ведет к необходимости механизмов, отвечающих за поддержание целостности генома – иначе самопроизвольное «перемешивание» ДНК просто выведет её из строя. Мобильные генетические элементы (МГЭ) – один из основных факторов нестабильности генома – представляют собой короткие нестабильные участки, которые могут автономно транскрибироваться и мигрировать по геному. Активация таких мобильных элементов приводит к множественным разрывам ДНК в хромосомах, чреватых летальными последствиями.

Количество МГЭ нелинейно увеличивается с размером генома, и их активность необходимо сдерживать. Для этого животные, уже начиная с кишечнополостных, используют всё тот же феномен РНК-интерференции. Эту функцию также выполняют короткие РНК, однако не те, о которых речь уже шла, а третий их тип – пиРНК.

«Портрет» пиРНК

пиРНК – короткие молекулы длиной в 24-30 нуклеотидов, закодированные в центромерных и теломерных областях хромосомы. Последовательности многих из них комплементарны известным мобильным генетическим элементам, однако есть множество других пиРНК, совпадающих с участками рабочих генов или с фрагментами генома, функции которых неизвестны.

пиРНК (также как и микроРНК) закодированы в обеих цепях геномной ДНК; они весьма изменчивы и разнообразны (до 500 000 (!) видов в одном организме). В отличие от киРНК и микроРНК, они образуются одной цепью с характерной особенностью – урацилом (U) на 5’-конце и метилированным 3’-концом. Есть и другие отличия:

• В отличие от киРНК и микроРНК, они не требуют процессинга Dicer’ом;
• Гены пиРНК активны только в зародышевых клетках (во время эмбриогенеза) и окружающих их эндотелиальных клетках;
• Белковый состав системы пиРНК иной – это эндонуклеазы класса Piwi (Piwi и Aub) и отдельная разновидность Argonaute – Ago3.

Процессинг и активность пиРНК пока достаточно плохо изучены, но уже ясно, что механизм действия совершенно отличается от других коротких РНК – сегодня предложена пинг-понг модель их работы (рис.5 А,Б).

Пинг-понг механизм биогенеза пиРНК

Рис. 5А: Цитоплазматическая часть процессинга пиРНК
Биогенез и активность пиРНК опосредуется семейством эндонуклеаз Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Активность пиРНК обеспечивается обеими одноцепочечными молекулами пиРНК – смысловой и анти-смысловой, – каждая из которых ассоциирует со специфической эндонуклеазой Piwi. пиРНК узнает комплементарный участок мРНК транспозона (синяя цепь) и вырезает его. Это не только инактивирует транспозон, но и создает новую пиРНК (связанную с Ago3 с помощью метилирования метилазой Hen1 3’-конца). Такая пиРНК, в свою очередь, узнаёт мРНК с транскриптами кластера предшественников пиРНК (красная цепь) – таким способом цикл замыкается и снова вырабатывается нужная пиРНК .

Рис. 5Б: пиРНК в ядре
Кроме эндонуклеазы Aub, антисмысловую пиРНК может связывать и эндонуклеаза Piwi. После связывания комплекс мигрирует в ядро, где вызывает деградацию комплементарных транскриптов и перестройку хроматина, вызывающую подавление активности транспозонов.

Функции пиРНК

Главная функция пиРНК – подавление активности МГЭ на уровне транскрипции и трансляции. Считается, что пиРНК активны только во время эмбриогенеза, когда непредсказуемые перетасовки генома особенно опасны и могут привести к гибели зародыша. Это логично – когда иммунная система ещё не заработала, клетки эмбриона нуждаются в какой-нибудь простой, но действенной защите. От внешних патогенов эмбрион надежно защищен плацентой (или оболочкой яйца). Но кроме этого необходима оборона и от эндогенных (внутренних) вирусов, – в первую очередь МГЭ.

Эта роль пиРНК подтверждена опытом – «нокаут» или мутации генов Ago3, Piwi или Aub приводят к серьёзным нарушениям развития (и резкому увеличению числа мутаций в геноме такого организма), а также вызывают бесплодие за счёт нарушения развития половых клеток.

Распространение и эволюция пиРНК

Первые пиРНК обнаруживаются уже у актиний и губок. Растения, видимо, пошли другим путём – белки Piwi у них не обнаружены, а роль «намордника» для транспозонов выполняют эндонуклеаза Ago4 и киРНК.

У высших животных – в том числе и человека – система пиРНК развита очень хорошо, но встретить её можно только в эмбриональных клетках и в околоплодном эндотелии. Почему распространение пиРНК в организме столь ограничено – ещё предстоит узнать. Можно предположить, что, как и любое мощное оружие, пиРНК приносит пользу только в очень специфических условиях (во время развития плода), а во взрослом организме их активность нанесёт больше вреда, чем пользы. Все-таки, число пиРНК на порядок превосходит количество известных белков – и неспецифические эффекты пиРНК в зрелых клетках сложно предсказать.

Сводная таблица. Свойства всех трёх классов коротких РНК

	киРНК	микроРНК	пиРНК
Распространение	Растения, Drosophila , C. elegans . Не найдено у позвоночных	Эукариоты	Эмбриональные клетки животных (начиная с кишечнополостных). Нет у простейших и растений
Длина	21-22 нуклеотидов	19-25 нуклеотидов	24-30 нуклеотидов
Структура	Двуцепочечная, по 19 комплементарных нуклеотидов и два неспаренных нуклеотида на 3’-конце	Одноцепочечная сложная структура	Одноцепочечная сложная структура. U на 5’-конце, 2’-O -метилированный 3’-конец
Процессинг	Dicer-зависимый	Dicer-зависимый	Dicer-независимый
Эндонуклеазы	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Активность	Деградация комплементарных мРНК, ацетилирование геномной ДНК	Деградация или ингибирование трансляции целевой мРНК	Деградация мРНК, кодирующих МГЭ, регуляция транскрипции МГЭ
Биологическая роль	Антивирусная иммунная защита, подавление активности собственных генов	Регуляция активности генов	Подавление активности МГЭ во время эмбриогенеза

Заключение

В заключение хочется привести таблицу, иллюстрирующую эволюцию белкового аппарата, участвующего в РНК-интерференции (рис.6). Видно, что у простейших наиболее развита система киРНК (белковые семейства Ago, Dicer), а с усложнением организмов акцент переносится на более специализированные системы – увеличивается число изоформ белков для микроРНК (Drosha, Pasha) и пиРНК (Piwi, Hen1). При этом разнообразие ферментов, опосредующих действие киРНК, уменьшается.

Рис. 6. Многообразие белков, участвующих в РНК-интерференци и
Цифры обозначают количество белков каждой группы. Синим цветом подсвечены элементы, характерные для киРНК и микроРНК, а красным – белки, связанные с пиРНК. По данным .

Явление РНК-интерференции начали использовать уже простейшие организмы. На основе этого механизма природа создала прототип иммунной системы, а по мере усложнения организмов РНК-интерференция становится незаменимым регулятором активности генома. Два разных механизма плюс три вида коротких РНК (см. сводную таблицу) – в результате мы видим тысячи тонких регуляторов различных метаболических и генетических путей. Эта поразительная картина иллюстрирует универсальность и эволюционную адаптацию молекулярных биологических систем. Короткие РНК снова доказывают, что «мелочей» внутри клетки нет – есть только мелкие молекулы, всю значимость роли которых мы только начинаем понимать.

Правда, такая фантастическая сложность говорит скорее о том, что эволюция «слепа» и действует без наперёд утверждённого «генерального плана» .

Литература

1. Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells . Nature 233, 177-182;
2. Спирин А. С. (2001). Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни . Вестник РАН 71, 320-328;
3. Элементы: «Полные митохондриальные геномы вымерших животных теперь можно извлекать из волос »;
4. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature 391, 806-311;
5. Биомолекула: «МикроРНК впервые обнаружены в одноклеточном организме »;
6. Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Plants combat infection by gene silencing . Nature 385, 781-782;
7. Биомолекула: «Молекулярное двурушничество: гены человека работают на вирус гриппа »;
8. Ren B. (2010). Transcription: Enhancers make non-coding RNA . Nature 465, 173–174;
9. Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). NF-κB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses . Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 12481-12486;
10. O’Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). Sustained expression of microRNA-155 in hematopoietic stem cells causes a myeloproliferative disorder . J. Exp. Med. 205, 585-594;
11. Биомолекула: «микроРНК – чем дальше в лес, тем больше дров »;
12. Элементы: «Усложнение организма у древних животных было связано с появлением новых регуляторных молекул »;
13. Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals . Nature 455, 1193–1197.
14. Aravin A., Hannon G, Brennecke J. (2007). The Piwi-piRNA Pathway Provides an Adaptive Defense in the Transposon Arms Race . Science 318, 761–764;
15. Биомолекула: «

Малые РНК, образующие шпильки, или короткие РНК, образующие шпильки (shRNA short hairpin RNA, small hairpin RNA) молекулы коротких РНК, образующие во вторичной структуре плотные шпильки. ShRNA могут быть использованы для выключения экспрессии… … Википедия

РНК-полимераза - из клетки T. aquaticus в процессе репликации. Некоторые элементы фермента сделаны прозрачными, и цепи РНК и ДНК видны более отчётливо. Ион магния (жёлтый) располагается на активном участке фермента. РНК полимераза фермент, осуществляющий… … Википедия

РНК-интерференция - Доставка малых РНК, содержащих шпильки, при помощи вектора на основе лентивируса и механизм РНК интерференции в клетках млекопитающих РНК интерференция (а … Википедия

РНК-ген - Некодирующие РНК (non coding RNA, ncRNA) это молекулы РНК, которые не транслируются в белки. Ранее использовавшийся синоним, малые РНК (smRNA, small RNA), в настоящее время не используется, так как некоторые некодирующие РНК могут быть очень… … Википедия

Малые ядерные РНК - (мяРНК, snRNA) класс РНК, которые встречаются в ядре эукариотических клеток. Они транскрибируются РНК полимеразой II или РНК полимеразой III и участвуют в важных процессах, таких как сплайсинг (удаление интронов из незрелой мРНК), регуляции … Википедия

Малые ядрышковые РНК - (мякРНК, англ. snoRNA) класс малых РНК, участвующих в химических модификациях (метилировании и псевдоуридилировании) рибосомных РНК, а также тРНК и малых ядерных РНК. По классификации MeSH малые ядрышковые РНК считаются подгруппой… … Википедия

малые ядерные (низкомолекулярные ядерные) РНК - Обширная группа (105 106) ядерных РНК небольшого размера (100 300 нуклеотидов), ассоциированная с гетерогенной ядерной РНК, входят в состав мелких рибонуклеопротеиновых гранул ядра; М.я.РНК являются необходимым компонентом системы сплайсинга… …

малые цитоплазматические РНК - Локализованные в цитоплазме небольшие (100 300 нуклеотидов) молекулы РНК, аналогичные малым ядерным РНК. [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый словарь генетических терминов 1995 407с.] Тематики генетика EN scyrpssmall cytoplasmic… … Справочник технического переводчика

малые ядерные РНК класса U - Группа ассоциированных с белками небольших (от 60 до 400 нуклеотидов) молекул РНК, составляющих значительную часть содержимого сплайсом и участвующих в процессе вырезания интронов; у 4 из 5 хорошо изученных типов Usn РНК U1, U2, U4 и U5 на 5… … Справочник технического переводчика

РНК биомаркеры - * РНК біямаркёры * RNA biomarkers огромное количество человеческих транскриптов, не кодирующих синтез белков (нсбРНК или npcRNA). В большинстве случаев малые (miRNA, snoRNA) и длинные (antisense RNA, dsRNA и др. виды) молекулы РНК являются… … Генетика. Энциклопедический словарь

Книги

• Купить за 1877 грн (только Украина)
• Клиническая генетика. Учебник (+CD) , Бочков Николай Павлович, Пузырев Валерий Павлович, Смирнихина Светлана Анатольевна. Все главы переработаны и дополнены в связи с развитием медицинской науки и практики. Существенно дополнены главы по многофакторным заболеваниям, профилактике, лечению наследственных болезней,…

Разрушение целевой мРНК может происходить также под действием малых интерферирующих РНК (Small interfering RNA, siRNA). Интерференция РНК - одно из новых революционных открытий в молекулярной биологии, а его авторы в 2002 г получили за него Нобелевскую премию. Интерферирующие РНКрезко отличаются по строению от других типов РНК и представляют собой две комплиментарные молекулы РНК длиной примерно в 21-28 азотистых основа­ний, которые соединены друг с другом как нити в молекуле ДНК. При этом по краям каждой из цепей siRNA всегда остается два неспаренных нуклеотида. Воздействие осуществляется следующим образом. Когда молекула siRNA оказыва­ется внутри клетки, она на первом этапе связывается в комплекс с двумя внутриклеточными ферментами - хеликазой и нуклеазой. Этот комплекс получил название RISC (R NA-i nduced s ilencing c omplex; silence - англ. молчать, замолкать; silencing - замолкание, так в англоязычной и специальной литературе называют процесс "выключения" гена). Далее хеликаза расплетает и разъединяет нити siRNA, и одна из нитей (антисмысловая по строению) в комплексе с нуклеазой специфически взаимо­действует с комплементарным (строго соответствующим ей) участком целевой мРНК, что позволяет нуклеазе разрезать ее на две части. Разрезанные участки мРНК далее подвергаются действию других клеточных РНК-нуклеаз, которые доразрезают их на более мелкие куски.

Обнаруженные у растений и низших животных организмов (насекомые) siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужеродную РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму. Установлено, что система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции. Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

В настоящее время этот метод используется в основном в научных исследованиях для выявления функций различных клеточных белков. Однако потенциально он так же может быть использован и для создания лекарственных препаратов.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной и противораковой терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.

Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих для терапевтических целей, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Однако существует целый ряд проблем, которые в настоящее время не позволяют осуществить это на практике, а тем более создать какие то лекарственные формы. Во-первых, в крови на них действует первый эшелон защиты организма, ферменты - нуклеазы , которые разрезают потенциально опасные и необычные для нашего организма двойные цепочки РНК. Во-вторых, несмотря на свое название, малые РНК все же достаточно длинны, а, главное, они несут отрицательный электростатический заряд, что делает невозможным их пассивное проникновение в клетку. И в - третьих, один из самых главных вопросов состоит в том, как заставить siRNA работать (или проникать) только в определенных ("больных") клетках, не затронув при этом здоровых? И, наконец проблема размера. Оптимальный размер таких синтетических siRNA те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC. Следует отметить, что преодоление этих проблем критически важно не только для терапии siRNA, но и для генной терапии вообще.

В их решении уже сейчас достигнут некоторый прогресс. Например, ученые пытаются путем химических модификаций сделать молекулы siRNA более липофильными , то есть способными растворяться в жирах, из которых состоит клеточная мембрана, и таким путем облегчить проникновение siRNA внутрь клетки. А чтобы обеспечить специфичность работы внутри только лишь определенных тканей, генные инженеры включают в состав своих конструкций специальные регуляторные участки, которые активизируются и запускают считывание информации, заключенной в подобной конструкции (а значит, и siRNA, если она туда включена), только в клетках определенных тканей.

Так исследователи из Медицинской Школы в Сан-Диего при Калифорнийском Университете (University of California, San Diego School of Medicine) разработали новую эффективную систему доставки малых интерферирующих РНК (siRNA), подавляющих продукцию определенных белков, в клетки. Эта система должна стать основой технологии специфической доставки лекарственных препаратов в различные типы раковых опухолей. «Малые интерферирующие РНК, осуществляющие процесс так называемой РНК-интерференции, обладают невероятным потенциалом для лечения рака», объясняет профессор Стивен Доуди (Steven Dowdy), руководивший исследованием: «и, хотя нам предстоит еще очень много сделать, на данный момент мы разработали технологию доставки препаратов в популяцию клеток – как первичной опухоли, так и метастазов, не повреждая при этом здоровые клетки».

Многие годы Доуди и его коллеги занимались изучением противоракового потенциала малых интерферирующих РНК. Однако обычные siRNA – крохотные отрицательно заряженные молекулы, которые из-за их свойств крайне сложно доставить в клетку. Чтобы добиться этого, ученые использовали короткий сигнальный белок PTD (peptide transduction domain). Ранее с его применением было создано более 50 «гибридных белков», в которых PTD был соединен с белками-супрессорами опухолевого роста.

Однако простое соединение siRNA с PTD не приводит к доставке РНК в клетку: siRNA заряжены отрицательно, PTD – положительно, в результате чего образуется плотный РНК-белковый конгломерат, не транспортирующийся через клеточную мембрану. Поэтому исследователи сначала соединили PTD с белковым РНК-связывающим доменом, который нейтрализовал отрицательный заряд siRNA (получив гибридный белок, названный PTD-DRBD). Такой РНК-белковый комплекс уже без труда проходит через клеточную мембрану и попадает в цитоплазму клетки, где специфически ингибирует матричные РНК белков, активирующих рост опухоли.

Чтобы выявить способность гибридного белка PTD-DRBD доставлять в клетки siRNA, ученые использовали клеточную линию, полученную из рака легких человека. После обработки клеток PTD-DRBD-siRNA было обнаружено, что наиболее восприимчивыми к siRNA являются клетки опухоли, в то время как в нормальных клетках (в качестве контроля использовались Т-клетки, эндотелиальные клетки и эмбриональные стволовые клетки), где не происходило повышенной продукции онкогенных белков, токсических эффектов не наблюдалось.

Данный метод можно подвергать различным модификациям, используя разные siRNA для подавления разных опухолевых белков – не только продуцирующихся в излишнем количестве, но и мутантных. Также возможно модифицировать терапию в случае рецидивов опухолей, которые обычно за счет новых мутаций становятся невосприимчивыми к химиотерапевтическим препаратам.

Онкологические заболевания очень вариабельны, а молекулярные характеристики белков опухолевых клеток индивидуальны для каждого пациента. Авторы работы считают, что в данной ситуации применение малых интерферирующих РНК – наиболее рациональный подход к терапии.

Длина siRNA 21-25 п.н., они образуются из дцРНК. Источником таких РНК могут быть вирусные инфекции, введенные в геном генетические конструкции, длинные шпильки в составе транскриптов и двунаправленная транскрипция мобильных элементов.
дцРНК нарезаются РНКазой Dicer на фрагменты длиной 21-25 п.н. с выступающими на 2 нуклеотида 3"-концами, после чего одна из цепей входит в состав RISC и направляет разрезание гомологичных РНК. В составе RISC присутствуют siRNA, соответствующие как плюс-, так и минус- цепям дцРНК. siRNA не имеют собственных генов и представляют собой фрагменты более длинных РНК. siRNA направляют разрезание РНК-мишени, поскольку полностью ей комплементарны. У растений, грибов и нематод в процесс подавления экспрессии генов вовлечены РНК-зависимые РНК-полимеразы, для которой siRNA служат еще и праймерами (затравками для синтеза новой РНК). Образовавшаяся дцРНК нарезается Dicer, образуются новые siRNA, которые являются вторичными. Таким образом происходит амплификация сигнала.

РНК-интерференция

В 1998 году Craig C. Mello и Andrew Fire опубликовали в Nature , в которой говорилось, что двуцепочечные РНК (дцРНК) способны подавлять экспрессию генов. Позже выяснилось, что действующее начало в этом процессе- короткие одноцепочечные РНК. Механизм подавления экспрессии генов с помощью этих РНК назван
РНК-интерференцией, а также РНК-сайленсингом. Такой механизм обнаружен у всех крупных таксонов эукариот: позвоночных и беспозвоночных животных, растений и грибов. В 2006 году за это открытие получена Нобелевская премия.
Подавление экспрессии может происходить на уровне транскрипции или посттранскрипционно. Оказалось, что во всех случаях необходим сходный набор белков и короткие (21-32 п.н.) РНК .
siRNA регулируют активность генов двумя способами. Как говорилось выше, они направляют разрезание РНК-мишеней. Это явление получило название "подавление" (quelling ) у грибов, "посттрансляционный сайленсинг генов " у растений и "РНК-интерференция " у животных. в этих процессах участвуют siRNA длиной 21-23 п.н. Другой тип воздействия- siRNA способны подавлять транскрипцию генов, содержащих гомологичные siRNA-последовательности. Это явление было названо транскрипционным сайленсингом генов (TGS) и обнаружено у дрожжей, растений и животных. siRNA направляют и метилирование ДНК, что приводит к образованию гетерохроматина и репрессии транскрипции. Лучше всего TGS изучен у дрожжей S.pombe , обнаружено, что у них siRNA встраиваются в похожий на RISC белковый комплекс, названный RITS. В его случае,как и в случае RISC, siRNA взаимодействует с белком семейства AGO. Вероятно, siRNA способна направлять этот комплекс к гену, который содержит гомологичный siRNA фрагмент. После этого белки RITS рекрутируют метилтрансферазы, в результате чего в локусе, кодирующем ген-мишень siRNA, формируется гетерохроматин, и активная экспрессия гена прекращается.

Роль в клеточных процессах

Каково же значение siRNA в клетке?
siRNA вовлечены в защиту клетки от вирусов, репрессию трансгенов, регуляцию некоторых генов и формирование центромерного гетерохроматина. Важная функция siRNA-подавление экспрессии мобильных генетических элементов. Такое подавление может происходить как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно.
Геном некоторых из вирусов состоит из ДНК, у некоторых же - из РНК, причем, РНК у вирусов может быть как одно-, так и двуцепочечной. Сам процесс разрезания чужеродной (вирусной) мРНК в этом случае происходит так же, как было описано выше, то есть путем активации комплекса ферментов RISC. Однако для большей эффективности растения и насекомые изобрели своеобразный путь усиления защитного действия siRNA. Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA может с помощью комплекса ферментов DICER сначала достроить вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая таким образом разнообразные "вторичные" siRNA. Они, в свою очередь, формируют RISC и проводят мРНК через все стадии, о которых шла речь выше, вплоть до ее полного уничтожения. Такие "вторичные" молекулы смогут специфично связываться не только с тем участком вирусной мРНК, к которому была направлена "первичная" молекула, но также и с другими участками, что резко усиливает эффективность клеточной защиты.

Таким образом, у растений и низших животных организмов siRNA являются важным звеном своеобразного "внутриклеточного иммунитета ", позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК - содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, система siRNA будет мешать ему производить вирусные белки (так как необходимая для этого мРНК будет распознаваться и разрезаться), и с помощью этой стратегии замедлит его распространение по организму.

У млекопитающих же, в отличие от насекомых и растений, работает и другая система защиты. При попадании в "зрелую" (дифференцированную) клетку млекопитающего чужой РНК, длина которой больше 30 п.н., клетка начинает синтез интерферона. Интерферон, связываясь со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, способен стимулировать в клетке целую группу генов. В результате в клетке синтезируется несколько видов ферментов, которые тормозят синтез белков и расщепляют вирусные РНК. Кроме того, интерферон может действовать и на соседние, еще не зараженные клетки, блокируя тем самым возможное распространение вируса.

Как можно заметить, обе системы во многом схожи: у них общая цель и "методы" работы. Даже сами названия "interferon" и "(RNA) interference" происходят от общего корня. Но есть у них и одно очень существенное различие: если интерферон при первых признаках вторжения просто "замораживает" работу клетки, не позволяя (на всякий случай) производство многих, в том числе и "невиновных" белков в клетке, то система siRNA отличается чрезвычайной разборчивостью: каждая siRNA будет распознавать и уничтожать только свою, специфическую мРНК. Замена всего лишь одного нуклеотида внутри siRNA ведет к резкому снижению эффекта интерференции . Ни один из блокаторов генов, известных до сих пор, не обладает такой исключительной специфичностью по отношению к своему гену-мишени.

Открытие РНК-интерференции дало новую надежду в борьбе со СПИДом и онкологическими заболеваниями. Возможно, применяя терапию siRNA вместе с традиционной антивирусной терапией, можно достичь эффекта потенцирования, когда два воздействия приводят к более выраженному лечебному эффекту, чем простая сумма каждого из них, применяемого по отдельности.
Для того, чтобы использовать механизм siRNA - интерференции в клетках млекопитающих, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы siRNA. Оптимальный размер таких синтетических siRNA при этом составляет те же 21-28 нуклеотидов. Если увеличить ее длину - клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Синтетические siRNA могут попасть как в зараженные, так и в здоровые клетки, и снижение выработки белков в незараженных клетках будет крайне нежелательным. С другой стороны, если попытаться применять siRNA меньшие, чем 21 нуклеотид, резко снижается специфичность ее связывания с нужной мРНК и способность к формированию комплекса RISC.

Если удастся тем или иным способом доставить siRNA, обладающую способностью связываться с каким-либо участком генома ВИЧ (который, как известно, состоит из РНК), можно попытаться не допустить его встраивания в ДНК клетки хозяина. Кроме того, ученые разрабатывают пути воздействия на различные этапы размножения ВИЧ в уже зараженной клетке. Последний подход не обеспечит излечение, однако может существенно уменьшить скорость размножения вируса и дать загнанной в угол иммунной системе шанс "отдохнуть" от вирусной атаки, и самой попытаться расправиться с остатками заболевания. На рисунке те два этапа размножения ВИЧ в клетке, которые, как надеются ученые, можно заблокировать с помощью siRNA, отмечены красными крестами (этапы 4-5 - встраивания вируса в хромосому, и этапы 5-6 - сборка вируса и выход из клетки).


На сегодняшний день, правда, все вышесказанное относится лишь к области теории. На практике терапия siRNA встречается с затруднениями, обойти которые ученым пока не удается. Например, в случае антивирусной терапии именно высокая специфичность siRNA может сыграть злую шутку: как известно, вирусы обладают способностью быстро мутировать, т.е. изменять состав своих нуклеотидов. Особенно преуспел в этом ВИЧ, частота изменений которого такова, что у человека, заразившегося одним подтипом вируса, через несколько лет может быть выделен абсолютно непохожий на него подтип. В этом случае измененный штамм ВИЧ автоматически станет нечувствительным к siRNA, подобранной в начале терапии.

Старение и канцерогенез

Как и любой эпигенетический фактор, siRNA влияют на экспрессию генов, которые заставляет "молчать". Сейчас появляются работы, в которых описаны эксперименты по выключению генов, ассоциированных с опухолями. Гены выключают (knock-down) именно с помощью siRNA. Например, китайские ученые с помощью siRNA выключали ген транскрипционного фактора 4 (TCF4), активность которого служит причиной синдрома Pitt-Hopkins (очень редкое генетическое заболевание, характеризующееся умственной отсталостью и эпизодами гипервентиляции и апноэ) и других умственных заболеваний. В данной работе проводилось изучение роли TCF4 в клетках рака желудка. Эктопическая экспрессия TCF4 снижает рост клеток в линиях клеток рака желудка, выключение гена TCF4 с помощью siRNA повышает миграцию клеток. Таким образом, можно сделать вывод, что эпигенетическое выключение (сайленсинг) гена TCF4 играет важную роль в образовании и развитии опухоли.

Согласно исследованиям в Department of Oncology, Albert Einstein Cancer Center под руководством Leonard H. Augenlicht siRNA участвует в выключении гена HDAC4 , что вызывает ингибирование роста раковой опухоли толстой кишки, апоптоз и повышение транскрипции p21. HDAC4- это гистоновая деацетилаза, которая является тканеспецифичной, подавляет дифференцировку клеток и ее экспрессия подавлена в течение процесса дифференцировки клеток. В работе показано, что HDAC4 является важным регулятором пролиферации клеток толстой кишки (что имеет значение при раковом процессе), а ее в свою очередь регулируют siRNA.

В Department of Pathology, Nara Medical University School of Medicine в Японии проводились исследования рака простаты. Репликативное старение клеток- это барьер против неконтролируемого деления и канцерогенеза. Короткоживущие делящиеся клетки (TAC) являются частью популяции клеток простаты, из которой и образуется опухоль. Японские ученые изучали причины, по которым эти клетки преодолевают старение. В клетки простаты в культуре были трасфецированы junB siRNA. В этих клетках наблюдается повышенный уровень экспрессии p53, p21, p16 и pRb, выявляемый при старении. Клетки в культуре, которые показали пониженный уровень p16, использовались для следующего этапа. Повторная трансфекция siRNA в TAC позволила клеткам избежать старения при инактивации p16/pRb. Кроме того сайленсинг прото-онкогена junB с помощью junB siRNA вызывает инвазию клеток. На основании этого был сделан вывод, что junB является элементом для p16 и способствует клеточному старению, препятствующему малигнизации (озлокачествлению)TAC. Таким образом, junB является регулятором канцерогенеза в простате и может быть целью для терапевтического воздействия. А регулировать его активность можно с помощью siRNA.

Подобных исследований проводится огромное множество. В настоящее время siRNA- это не только объект, но и инструмент в руках исследователя- врача, биолога, онколога, геронтолога. Исследование связи siRNA с онкологическими заболеваниями, с экспрессией возраст-ассоциированных генов- это важнейшая задача для науки. Прошло совсем немного времени с момента открытия siRNA, а сколько появилось интересных исследований и публикаций, связанных с ними. Можно не сомневаться, что их изучение станет одним из шагов человечества к победе над раком и старением...